La présence de Calvin va avoir un impact durable dans la cité lémanique et bien au-delà, et la théocratie qu’il tente d’instaurer ne laisse personne indifférent, que l’on apprécie ou non son idéal de faire de Genève la nouvelle « ville sainte ».

Sous Calvin, la cité change radicalement, à cause bien sûr de la nouvelle forme de gouvernement qu’il y introduit, mais aussi, et surtout, de l’afflux massif de protestants français, italiens, néerlandais et anglais qui fuient les persécutions dont ils sont l’objet dans le reste de l’Europe. Ces nouveaux venus tendent tout naturellement à soutenir Calvin, ce qui déplait à la bourgeoisie locale qui craint pour son pouvoir et son influence. En 1555, une rébellion contre les réfugiés est réprimée et permet à Calvin d’asseoir solidement son autorité.

Les réfugiés les plus fidèles sont formés à l’exercice du ministère afin d’aller répandre la doctrine de Calvin dans d’autres contrées. Parmi ces disciples, on citera John Knox qui, de retour dans son pays d’origine, y fondera l’Église d’Écosse.

Il y a, parmi ces réfugiés, une grande concentration d’imprimeurs et d’éditeurs qui contribuent aussi à l’essor de la nouvelle religion en imprimant les textes bibliques et les traités de théologie. De plus, l’Académie fondée en 1559 attire un grand nombre de professeurs et d’étudiants étrangers à Genève.

Les persécutions religieuses font aussi converger de nombreux artisans vers la cité de Calvin, notamment des banquiers qui vont contribuer au développement de la ville.

Parmi les opposants les plus acharnés à la ville, la Maison de Savoie cherche régulièrement à faire valoir ses prétentions territoriales.

Le duc Charles-Emmanuel Ier de Savoie tente un dernier coup de main pour reprendre Genève en 1602, mais la garde donne l’alerte et les Genevois repoussent l’assaillant qui cherche à franchir les murs de la ville à l’aide de grandes échelles, d’où le nom de « L’Escalade » donné à cet épisode.

Suite à cette défaite, le duc de Savoie est contraint de signer le Traité de Saint-Julien (1603) par lequel il renonce définitivement à Genève.